شناسایی آنزیم تجزیه کننده آفلاتوکسین در Bacillus subtilis UTB1 با استفاده از جهش زایی هدفمند
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
در سال‌های اخیر سم‌زدایی بیولوژیکی مواد غذایی و علوفه آلوده به آفلاتوکسینها توسط برخی ایزوله‌های باکتریایی و قارچی بررسی شده است. برخی باکتریها قادر به تجزیه آفلاتوکسینها به ترکیبات غیر‌سمی یا باسمیت کمتر می‌باشند که در اکثر موارد تجزیه آنزیمی صورت می‌گیرد. در این مطالعه از سویه Bacillus subtilis UTB1 که قادر است آفلاتوکسین را به میزان قابل توجهی تجزیه کند، استفاده گردید. به منظور پی بردن به آنزیم‌های موثر در تجزیه آفلاتوکسین در B. subtilis UTB1، جهش زایی هدفمند با استفاده از روش Fusion PCR با هدف تخریب ژن bacC انجام شد تا از بیوسنتز آنزیم باسیلایسین اکسیدورداکتاز (یک آنزیم همولوگ با یکی از آنزیم‌های تجزیه‌کننده آفلاتوکسین در Mycobacterium smegmatis) ممانعت کند. ژن bacC سومین ژن در مسیر بیوسنتز آنتی‌بیوتیک دی پپتیدی باسیلایسین در برخی گونه های باسیلوس می‌باشد. به منظور انتقال محصول Fusion PCR به سویه B. subtilis UTB1، ابتدا قطعه مزبور درون باکتری E. coli DHα5 کلون شده و سپس به درون سویه UTB1 B. subtilis به روش پروتوپلاست الکتروپوریشین منتقل گردید. به منظور اطمینان از تخریب ژن bacC و کاهش تولید آفلاتوکسین درکلونی‌های رشد یافته روی محیط حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین، کلونی‌ها از نظر ملکولی و فنوتیپی آزمایش شدند. بررسی ملکولی شامل آنالیز PCR و توالی‌یابی قطعه تکثیر یافته در ترانسفورمانت‌های حاصل بود که مشخص کرد ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک کانامایسین جایگزین ژن هدف (bacC) شده و به این ترتیب این ژن تخریب گردیده است، در نتیجه محصول پروتئینی آن یعنی آنزیم باسیلایسین اکسیدورداکتاز نمی‌تواند تولید شود. برای مقایسه فنوتیپی جهش‌یافته‌های bacC با سویهB. subtilis UTB1 ، به عصاره‌های فاقد سلولی آنها آفلاتوکسین استاندارد B1 اضافه شده و بعد از 72 ساعت نگهداری در دمای 37 درجه سلسیوس مقدار آفلاتوکسین سنجش شد. نتایج نشان داد که مقدار آفلاتوکسین باقیمانده در عصاره‌های فاقد سلولی سه جهش‌یافته bacC افزایش معنی‌داری (p≤0.01) در مقایسه با سویه وحشی UTB1 یافته است. بدین ترتیب مشخص می‌شود که آنزیم باسیلایسین اکسیدوردکتاز، نقش موثری در تجزیه آفلاتوکسین دارد چرا که تجزیه آفلاتوکسین در جهش‌یافته‌های این ژن در مقایسه با سویه مادری به مقدار زیادی کاهش یافته است. بین جهش‌یافته‌ها نیز با با شاهد (فاقد عصاره خارج سلولی باکتری) از لحاظ کاهش میزان آفلاتوکسین محیط کشت مایع اختلاف معنی‌داری (p≤0.01) مشاهده می‌شود. بنابراین یافته‌های این تحقیق پیشنهاد می‌کند که آنزیم باسیلایسین اکسیدوردکتاز می‌تواند یکی از آنزیم‌هایی باشد که در تجزیه آفلاتوکسین در سویه UTB1 B. subtilis نقش دارد.
کلیدواژه ها