استفاده از روش IC-RT- PCR به منظور شناسایی جدایه‌های ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته داران از غرب و شمال غرب ایران
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
چکیده
درختان میوه هسته‌دار متعلق به تیره گل‌سرخیان گروه مهمی از میوه‌های مناطق معتدله هستند و شمال غرب ایران یکی از قطب‌های بزرگ تولید میوه‌های هسته‌دار می‌باشد. ویروس‌های درختان میوه هسته‌دار مهمترین عوامل کاهش کیفیت محصول، ریزش زود هنگام و ایجاد زوال و مرگ سریع درختان هستند. ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته‌داران (Prunus necrotic ringspot virus: PNRSV) از خانواده Bromoviridae و جنس Ilarvirus از ویروس های مهم خسارت‌زای این درختان در سراسر جهان و ایران است. دراین پژوهش 103 نمونه مشکوک دارای علائمی از جمله جوشهای ارغوانی، لکه‌های بافت مرده، کلروز و موزائیک هستند که از برخی مناطق استان‌های آذربایجان شرقی و زنجان جمع آوری گردید. برای شناسایی برخی از نمونه‌های مشکوک از آزمون IC-RT-PCR استفاده شد. بدین ترتیب، در واکنش IC-RT-PCR به میزان 100 میکرولیتر از آنتی بادی اختصاصی رقیق شده ویروس (شرکت بایوربا، سوییس) در میکروتیوب‌های PCR ریخته شد و به مدت 4 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس میکروتیوب‌ها سه مرتبه با بافر شستشو شسته شدند. 100 میکرولیتر از عصاره گیاهی در هر میکروتیوب ریخته شد و پس از نگهداری میکروتیوب‌ها به مدت شبانه در دمای 4 درجه سلسیوس، به روش قبلی شسته شد. واکنشRT-PCR در درون میکروتیوب‌ها در حجم نهایی 5/12 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر آب مقطر استریل و 5/0 میکرولیتر (5 پیکو مول) از هر آغازگر، 5/2 میکرولیتر از کیت سنتز cDNA و 5/6 میکرولیتر از PCR Master Mix انجام شد. از آغازگرهای اختصاصی به نام‌های PNRSVCP-R (آغازگر معکوس) و PNRSVCP-F (آغازگر مستقیم) مربوط به چارچوب ژنی پروتئین پوششی ویروس برای تکثیر قطعه‌ای در حدود 675 جفت باز استفاده شد. از بین نمونه‌های جمع‌آوری شده آلودگی 26 نمونه تائید و 11 نمونه به منظور تعیین توالی به شرکت بیونیر کره جنوبی ارسال شدند. همردیف‌سازی توالی بدست آمده با استفاده از برنامه CLASTAL-W با سایر توالی‌های مرتبط موجود در GenBank انجام گرفت و درخت فیلوژنتیکی توسط برنامه MEGA 6 و با روش Neighbor-joining رسم گردید. نتایج نشان داد این جدایه‌ها با جدایه‌های ایرانی که از میزبان رز جدا شده‌اند در یک خوشه قرار می‌گیرند و همه آنها متعلق به زیر گروه PV96-II هستند. نتایج این پژوهش بیانگر آلودگی گونه‌های مختلف درختان میوه هسته‌دار در برخی از مناطق غرب و شمالغرب ایران به PNRSV می‌باشد.
درختان میوه هسته‌دار متعلق به تیره گل‌سرخیان گروه مهمی از میوه‌های مناطق معتدله هستند و شمال غرب ایران یکی از قطب‌های بزرگ تولید میوه‌های هسته‌دار می‌باشد. ویروس‌های درختان میوه هسته‌دار مهمترین عوامل کاهش کیفیت محصول، ریزش زود هنگام و ایجاد زوال و مرگ سریع درختان هستند. ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته‌داران (Prunus necrotic ringspot virus: PNRSV) از خانواده Bromoviridae و جنس Ilarvirus از ویروس های مهم خسارت‌زای این درختان در سراسر جهان و ایران است. دراین پژوهش 103 نمونه مشکوک دارای علائمی از جمله جوشهای ارغوانی، لکه‌های بافت مرده، کلروز و موزائیک هستند که از برخی مناطق استان‌های آذربایجان شرقی و زنجان جمع آوری گردید. برای شناسایی برخی از نمونه‌های مشکوک از آزمون IC-RT-PCR استفاده شد. بدین ترتیب، در واکنش IC-RT-PCR به میزان 100 میکرولیتر از آنتی بادی اختصاصی رقیق شده ویروس (شرکت بایوربا، سوییس) در میکروتیوب‌های PCR ریخته شد و به مدت 4 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. سپس میکروتیوب‌ها سه مرتبه با بافر شستشو شسته شدند. 100 میکرولیتر از عصاره گیاهی در هر میکروتیوب ریخته شد و پس از نگهداری میکروتیوب‌ها به مدت شبانه در دمای 4 درجه سلسیوس، به روش قبلی شسته شد. واکنشRT-PCR در درون میکروتیوب‌ها در حجم نهایی 5/12 میکرولیتر شامل 5/2 میکرولیتر آب مقطر استریل و 5/0 میکرولیتر (5 پیکو مول) از هر آغازگر، 5/2 میکرولیتر از کیت سنتز cDNA و 5/6 میکرولیتر از PCR Master Mix انجام شد. از آغازگرهای اختصاصی به نام‌های PNRSVCP-R (آغازگر معکوس) و PNRSVCP-F (آغازگر مستقیم) مربوط به چارچوب ژنی پروتئین پوششی ویروس برای تکثیر قطعه‌ای در حدود 675 جفت باز استفاده شد. از بین نمونه‌های جمع‌آوری شده آلودگی 26 نمونه تائید و 11 نمونه به منظور تعیین توالی به شرکت بیونیر کره جنوبی ارسال شدند. همردیف‌سازی توالی بدست آمده با استفاده از برنامه CLASTAL-W با سایر توالی‌های مرتبط موجود در GenBank انجام گرفت و درخت فیلوژنتیکی توسط برنامه MEGA 6 و با روش Neighbor-joining رسم گردید. نتایج نشان داد این جدایه‌ها با جدایه‌های ایرانی که از میزبان رز جدا شده‌اند در یک خوشه قرار می‌گیرند و همه آنها متعلق به زیر گروه PV96-II هستند. نتایج این پژوهش بیانگر آلودگی گونه‌های مختلف درختان میوه هسته‌دار در برخی از مناطق غرب و شمالغرب ایران به PNRSV می‌باشد.
کلیدواژه ها