تولید پیکره‌های توخالی موزائیک نوار سبزرد قیاق (JCSMV-VLPs) در شرایط in vivo
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
ویروس‌ها محفظه‌های پروتئینی متشکل از صدها زیرواحد می‌باشند که به منظور مونتاژ با کارایی بالا در مدت زمان کم تکامل یافته‌اند. محفظه‌های خالی ویروس که بعنوان پیکره‌های شبه ویروس شناخته می‌شوند فاقد نوکلئیک اسید و غیرعفونی می‌باشند. امروزه استفاده از این پیکره‌های شبه ویروس در علم پزشکی در حال گسترش می‌باشد. پژوهش حاضر بر اساس تولید پیکره‌های شبه ویروس موزائیک نوار سبزرد قیاق (VLPs) متعلق به تیره Tombusviridae و جنس Aureusvirus می‌باشد. به منظور انجام آزمایش، از نمونه های آلوده به ویروس آران‌ا ویروس استخراج شد و سپس سنتز cDNA و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده آغازگرهای اختصاصی پروتئین پوششی دارنده سایت‌های برشی BamHI و SacI صورت گرفت. همسانه‌سازی ژن مربوط به پروتئین پوششی در وکتور pTZ57R/T و پس از تایید از طریق تعیین ترادف در وکتور بیان pBI121 انجام شد. سپس سازه ژنی تولید شده به روش ذوب-فریز به باکتری Agrobacterium rhizogenes منتقل شد. پس از تایید سازه منتقل شده به باکتری با استفاده از آزمون‌های واکنش هضم آنزیمی توسط آنزیم‌های برشی BamHI و SacI، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز از کلنی‌های باکتری دارنده سازه و تعیین ترادف، تزریق باکتری حاوی سازه به برگ‌های توتون (Nicotiana tabacum cv. Turkish) انجام گرفت. برگ‌های توتون به محیط MS به مدت سه روز و تا زمان ظهور کلنی‌های باکتریایی اطراف برگ‌ها نگه داشته شدند. سپس برگ‌ها به محیط MS دارای مارکرهای انتخابی کانامایسین50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و مروپنم 30 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر منتقل و بعد از 35 روز ریشه‌های مویین تولید شد. هر ریشه مویین به تنهایی بریده شد و به محیط MS مایع منتقل شد و پس از رشد به مدت یک ماه مورد بررسی قرار گرفت. ایجاد ریشه مویین و حضور ژن پروتئین پوششی در ریشه‌ها در آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به ترتیب با استفاده از آغازگرهای اختصاصی rolB و پروتئین پوششی و بیان پروتئین پوششی با استفاده ار آزمون الایزا مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت. پیکره‌های شبه ویروس (VLPs) مونتاژ شده با استفاده از سانتریفوژ درrpm 28000 به مدت دو ساعت خالص سازی گردید و نهایتا تایید مونتاژ پیکره‌ها بدون ژنوم با استفاده از میکروسکوپ الکترونی انجام گرفت. نتایج حاصل از تحقیق نشان داد که وکتور بیان pBI121 حامل ژن پروتئین پوششی ویروس می‌باشد و ریشه‌های مویین تولید شده در توتون سطح بالایی از پروتئین نوترکیب ویروس موزائیک نوار سبزرد قیاق را تولید میکند که به آسانی به شکل پیکره‌های شبه ویروس مونتاژ می‌گردد. عکس های بدست‌آمده از الکترون میکروسکوپی نشان داد که این پیکره‌ها از لحاظ ظاهری کاملا شبیه ویریون‌های تولید شده از طریق آلودگی می‌باشد.
کلیدواژه ها