ردیابی ویروس پیچیدگی برگ شلغم از علف هرز تاتوره در استان فارس
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
ویروس پیچیدگی برگ شلغم (Turnip curly top virus, TCTV)، از جنس Turncurtovirus و خانواده Geminiviridae است و برای نخستین بار در سال 1389 از مزارع شلغم استان فارس شناسایی گردید. علائم بیماری در مزارع شلغم شامل پیچیدگی حاشیه برگ به بالا، ضخیم و شکننده شدن برگ ها می‌باشد. در گذشته آلودگی طبیعی چهار گونه علف‌هرز بامیه سه‌شاخ، تاجریزی، ترب وحشی و خاکشیر که علائم خاصی هم نشان نمی‌دادند، با استفاده از واکنش پی‌سی‌آر به این ویروس اثبات شده است. جهت شناسایی میزبان‌های وحشی ویروس، تلاش شد از علف هرز تاتوره (Datura stramonium L.) مجاور مزارع شلغم با علائم پیچیدگی برگ و زردی خفیف نمونه برداری و استخراج دی‌ان‌ای انجام گیرد. با توجه به عدم موفقیت روش‌های مرسوم تکثیر ژنوم ویروس، به‌جای استفاده از دی‌ان‌ای استخراج شده از گیاه به روش CTAB، از محصول تکثیر شده به روش دایره غلطان با کمک آنزیم فی دی اِن اِ پلی مراز، به عنوان رشته الگو در واکنش پی سی آر برای تکثیر ژنوم ویروس استفاده شد. در این واکنش، از آنزیم دارای خاصیت تصحیح کنندگی (Pfx DNA polymerase) و جفت آغازگر اختصاصی انتها به انتها استفاده شد. این آغازگرها به گونه ای طراحی شده‌اند که دارای یک ناحیه همپوشان با یکدیگر در انتهای ꞌ5 بوده و با وجود تنوع زیاد جدایه‌های TCTV ، قابلیت اتصال در ناحیه‌ای حفاظت شده از ژنوم ویروس را دارند و در واکنش پی‌سی‌آر، طول کامل ژنوم ویروس را تکثیر می‌کنند. برای همسانه سازی قطعه حدود سه کیلو جفت بازی محصول پی‌سی‌آر تکثیر شده با آنزیم با صحت سنتز بالا، از پلاسمید pJET1.2 که خطی است و دارای انتهای صاف می‌باشد استفاده شد. این همسانه‌سازی با استفاده از کیت CloneJET PCR Cloning Kit و مراحل کار طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. در نهایت، پلاسمید نوترکیب حاصل برای تعیین ترادف به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال گردید. نتایج همردیف‌سازی و مقایسه ترادف نوکلئوتیدی این جدایه با 45 توالی موجود از ویروس‌های متعلق به این جنس در بانک جهانی ژن نشان داد که جدایه بدست آمده از علف هرز تاتوره در گروه C از گونه TCTV قرار می‌گیرد و میزان تشابه آن با سایر جدایه‌های مربوط به این جنس در بانک جهانی ژن از1/73 تا 2/99 % متغیر می‌باشد. با توجه به اینکه، دی‌اِن‌اِ استخراج شده از علف هرز برای آزمون PCR کیفیت مطلوبی ندارد، روش معمول تکثیر ژنوم ویروس با کیت تکثیر دایره غلتان، موفقیت آمیز نبود. بنابراین تلفیق تکثیر به‌روش دایره غلتان و پی‌سی‌آر دارای حساسیت بالائی بوده و روش مناسبی برای ردیابی است. با اطلاعات موجود، این نخستین ردیابی و تعیین توالی طول کامل ژنوم TCTV از علف‌های هرز در ایران می‌باشد.
کلیدواژه ها