بکارگیری تکنیک Multiplex PCR جهت ردیابی Fusarium verticillioides و F. proliferatum در ذرت

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

ذرت به عنوان یکی از محصولات استراتژیک به طور مستقیم و غیر مستقیم در زنجیره غذایی انسان و حیوانات مورد استفاده قرار می‌گیرد. گونه‌های فوزاریوم از جمله آلوده کننده‌های شایع این محصول در سراسر جهان محسوب می‌شوند. از آنجایی که بیمارگرهایF. proliferatum و F. verticillioides با تولید متابولیت‌های ثانویه در ذرت، سلامت جانداران را به خطرمی‌اندازند، ردیابی و شناسایی این عوامل بیماری‌زا در ذرت حائز اهمیت است. در تحقیق حاضر طی بازدید از انبارهای مختلف گاوداری و مرغداری استان‌های خراسان رضوی، مازندران، کرمانشاه و شیراز نمونه برداری ازدانه های ذرت دارای علائم بیماری قارچی انجام گرفت. نمونه‌ها در شرایط استاندارد به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه‌ها پس از شستشو با آب معمولی و ضدعفونی سطحی با هیپوکلریت سدیم یک درصد، به منظور جداسازی گونه‌های فوزاریوم دانه‌های ذرت روی محیط‌های WA و PDA کشت شدند و در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. 36 جدایه فوزاریوم جدا و خالص شده روی محیط کشت‌های PDA و CLA، بر اساس خصوصیات میکروسکپی (نوع فیالیدها، وجود یا عدم وجود میکروکنیدی، شکل ماکروکنیدی، وجود یا عدم وجود کلامیدوسپور) و ماکروسکپی (شکل، رنگ و قطر پرگنه) با استفاده از کلیدهای شناسایی مربوطه، دو گونه F. verticillioides و F. proliferatum با فراوانی به ترتیب 34 و 2 جدایه شناسایی شدند. جهت شناسایی مولکولی جدایه‌ها واکنش زنجیره‌ای پلیمراز اختصاصی (Specific PCR) انجام شد. بدین منظور پس از استخراج DNA از جدایه‌ها، با استفاده از آغازگر عمومی ITS1/ITS4 و جفت آغازگرهای اختصاصی گونه شامل (verITS-F/ITS4 (F. verticillioides و (ITS1/pro-ITSR (F.proliferatum توالی مورد نظر تکثیر و محصول واکنش از طریق الکتروفورز در ژل آگارز 1/5% مورد بررسی قرار گرفت. با مشاهده نوارهای DNA به ترتیب 620، 390 و 172 جفت بازی در واکنش مولکولی، نتایج شناسایی ریخت شناسی جدایه‌ها مورد تایید قرار گرفتند. باتوجه به اینکه ردیابی سریع گونه‌های فوزاریوم مولد مایکوتوکسین در ذرت حائز اهمیت است، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز چندگانه (Multiplex-PCR) با ترکیب دو جفت آغازگر اختصاصی verITS-F/ITS4 و ITS1/proITS-R جهت ردیابی دو گونه نام‌برده از دانه‌های ذرت که به طور طبیعی آلوده به قارچ فوزاریوم بودند انجام شد. در بررسی محصول PCR این واکنش با تکثیر قطعه 172 جفت بازی مشخص شد که، تمام نمونه‌های ذرت آلوده به گونه F. verticillioides هستند. درحالیکه تنها در یک نمونه، قطعه 390 جفت بازی توسط جفت آغازگر اختصاصی گونه F. proliferatum تکثیر گردید. نتایج بدست آمده از این تحقیق، شیوع بالای نمونه‌های ذرت به قارچ F. verticillioides را نشان می‌دهد، این بررسی نشان داد که تکنیک Multiplex PCR به عنوان روشی دقیق، علاوه بر تمایز بین دوگونه F. proliferatum و F. verticillioides امکان ردیابی همزمان این بیمارگرها را در دانه ذرت فراهم می‌کند.

آلودگی دانه؛ متابولیت ثانویه؛ آغازگر