عفونت زایی رونوشت ساخته شده در شرایط in vitro ویروئید اگزوکورتیس مرکبات (CEVd) در سیترنج

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

ویروئیدها با ماهیت آر. ان. ای. حلقوی تک لا به عنوان کوچکترین عوامل بیمارگر گیاهی بوده و فاقد چارچوب ژنی و پوشش پروتئینی هستند. به رغم مطالعات زیاد تاکنون سازوکار بیماری‌زایی ویروئیدها به وضوح مشخص نیست. بنابراین بررسی تغییرات در سطح رونویسی از ژن‌ها، پس از رونویسی و ترجمه محصولات ژن‌های گیاه میزبان که ناشی از تعامل بین ویروئید و میزبان است می‌تواند قدمی بزرگ در جهت شناخت سازوکار این بیمارگرها باشد. عامل بیماری اگزوکورتیس مرکبات، Citrus exocortis viroid, CEVd متعلق به جنس Pospiviroid و خانواده Pospiviroidae می‌باشد. ویروئید اگزوکورتیس مرکبات، همیشه بصورت یک جمعیت مرکب شامل مجموعه‌ای از واریانت‌های متنوع از لحاظ ژنتیکی است که بصورت یک مدل شبه گونه می‌توان آن را توصیف نمود. لذا به منظور ارزیابی تعامل بیمارگر و گیاه میزبان در پاتوسیستم اگزوکورتیس مرکبات، آلودگی مصنوعی میزبان توسط یک واریانت خالص از بیمارگر الزامی می‌باشد. در این پژوهش یک جدایه بدست آمده از پرتقال تامسون ناول (Citrus sinensis (L.) Osb. Cv. Thomson navel) بر پایه سیترنج (Poncirus trifoliata (L.) Raf. × C. sinensis (L.)) در استان مازندران، شهرستان ساری انتخاب شد. پس از استخراج آر. ان. ای. کل و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی در واکنش RT-PCR، دی. ان. ای. مکمل کامل جدایه ویروئید مورد بررسی تکثیر و پس از همسانه سازی، تعیین ترادف نوکلئوتیدی انجام گرفت. به منظور ساخت رشته آر. ان. ای. ویروئیدی، توالی نوکلئوتیدی کامل دی. ان. ای. مکمل ویروئید در در داخل تنها سایت برشی آنزیم EcoRI در پلاسمید pBHA سنتز شد. در ابتدای توالی یک پروموتر T7 آر. ان. ای. پلیمراز و در انتهای توالی ویروئیدی یک سایت برشی آنزیم SmaI تعبیه شد. پس از خطی شدن پلاسمید، با استفاده از آنزیم T7 آر. ان. ای. پلیمراز مولکول‌های آر. ان. ای. ویروئیدی رونویسی و دی. ان. ای. های باقی مانده توسط آنزیم DNase حذف شد. نهال‌های شش ماهه سیترنج عاری از ویروئید بوسیله خراش دادن پوست ساقه با تیغ آغشته به ویروئید ساخته شده در مرحله قبل، مایه‌زنی شدند و در شرایط کنترل شده گلخانه نگهداری شدند. چهار هفته پس از آلوده سازی، از گیاهان نمونه برداری صورت گرفت. ردیابی ویروئید با استفاده از تکنیک RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی انجام گرفت و برای اطمینان بیشتر توالی یابی صورت گرفت. بر اساس نتایج، توالی نوکلئوتیدی محصول پی سی آر یکسان با توالی جدایه اصلی بود. در مجموع، تکنیک نسخه‌برداری درون شیشه‌ای (in vitro Transcription) در ساخت ویروئید‌ها برای بدست آوردن یک جمعیت خالص و عفونت زا از آن‌ها بسیار کارآمد است.

ویروئید؛ اگزوکورتیس؛ سیترنج؛ درون شیشه ای؛ عفونت زایی